恒温培养箱之正常视网膜色素上皮细胞原代培养

2023-06-13 09:15 0

实验材料:

1. 材料来源:人眼、兔眼或者猪眼等;

2. 清洗液:不含Ca2+和Mg2+的1×PBS,添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素,pH7.

3. 特殊取材器械:眼球托与7-0尼龙线。以灭菌的白色橡胶反口胶塞作为眼球托;

4. 消毒液:200IU/ml的庆大霉素生理盐水;

5. 消化液:0.01%EDTA-0.125%胰蛋白酶的混合消化液;

6. 培养液:为含10%胎牛血清的DMEM培养液;

7. 培养器皿:培养瓶、24孔培养板或恒温培养箱、培养皿若干。

实验方法:

1. 摘取眼球,用200IU/ml的庆大霉素生理盐水浸泡消毒5min。沿锯齿缘后2—3mm处环形剪开眼球前段,去除角膜、晶状体以及玻璃体。分离去掉视网膜神经上皮层。将眼球后段制成眼杯;

2. 将眼杯置于眼球托(可以洗净消毒过的盐水瓶胶塞替代)上,取持针器用7-0尼龙线在4个对称方向上,把眼杯缝合固定在眼球托的壁缘上;

3. 用毛细吸管轻轻从眼杯中吸出视网膜神经上皮层。以PBS液漂洗眼杯2次,吸干;

4. 加入0.01%EDTA-0.125%胰蛋白酶的混合消化液,置于无菌的烧杯中。于37℃恒温箱中消化30min;

5. 吸去消化液。用PBS液稍洗。加入有血清培养液终止消化酶的作用,并用毛细吸管轻轻吹打眼杯内壁,以使视网膜色素上皮细胞脱落;

6. 收集眼杯内的细胞悬液,离心(800r/min)8min;

7. 弃上清液,将沉淀的视网膜色素上皮细胞重新用培养液悬浮。计数;

8. 以8×104—10×104个/ml的密度接种于培养瓶中;

9. 送人恒温培养箱中,按常规方法培养,每周换液2次;

10. 也可直接用机械分离植块法:用无齿镊撕下视网膜色素上皮细胞层,经PBS漂洗后,将其剪成1.5mm×1.5mm大小的组织块,直接接种于24孔培养板进行培养。

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