基于恒温恒湿培养箱的口腔链球菌产酸能力与龋齿相关性实验研究
2025-07-10 10:32 0次
龋齿作为全球高发的口腔疾病，其发病机制与口腔微生物群落的代谢活动密切相关，其中口腔链球菌的产酸能力被认为是诱发龋齿的关键因素之一。本实验通过恒温恒湿培养箱模拟口腔微环境，系统分析口腔链球菌的产酸能力与龋齿发生发展的相关性，为龋齿的预防与干预提供实验依据。
实验材料与方法
菌株与培养条件
选取临床分离的3株口腔链球菌标准菌株（变形链球菌ATCC 25175、血链球菌ATCC 10556、缓症链球菌ATCC 9811），均购自中国微生物菌种保藏中心。采用脑心浸液（BHI）培养基进行活化培养，恒温恒湿培养箱设定参数为37℃、相对湿度95%、5%CO₂，模拟人体口腔的生理环境。
产酸能力测定
将活化后的菌株接种至含2%葡萄糖的BHI液体培养基中，在上述恒温恒湿条件下分别培养2h、4h、6h、8h、12h、24h。采用精密pH计测定各时间点的培养基pH值，计算pH下降速率；同时通过高效液相色谱（HPLC）检测培养液中乳酸、乙酸等有机酸的含量，色谱条件为：C18色谱柱（250mm×4.6mm），流动相为0.02mol/L磷酸二氢钾溶液（pH 2.5），流速1.0mL/min，检测波长210nm。
龋齿模型构建
选用60只SPF级SD大鼠（体重180-220g），随机分为对照组、变形链球菌组、血链球菌组、缓症链球菌组，每组15只。实验组大鼠经口腔涂布相应菌株悬液（1×10⁸CFU/mL），每日1次，连续7天；对照组涂布等量无菌生理盐水。所有大鼠均给予致龋饲料（含56%蔗糖）和自由饮水，饲养环境温度25℃，相对湿度50%-60%。饲养4周后处死大鼠，剥离上下颌骨，采用Keyes龋齿评分法评估龋齿病变程度，统计釉质龋、牙本质浅龋及深龋的发生率。
实验结果
口腔链球菌的产酸动力学特征
在恒温恒湿培养条件下，3株口腔链球菌均表现出明显的产酸能力，但产酸速率与有机酸组成存在显著差异。变形链球菌在培养6h时培养基pH值从初始7.2降至4.5，pH下降速率达0.45/h，显著高于血链球菌（0.28/h）和缓症链球菌（0.21/h）（P<0.05）。HPLC检测显示，变形链球菌培养液中乳酸含量最高，24h时达32.6mmol/L，占总有机酸的78.3%；血链球菌和缓症链球菌的乳酸占比分别为65.2%和58.7%，且乙酸含量相对较高。
龋齿模型病变程度分析
4周饲养后，变形链球菌组大鼠龋齿发生率为100%，其中牙本质深龋发生率达68.5%，显著高于血链球菌组（32.2%）和缓症链球菌组（21.7%）（P<0.01）。对照组大鼠仅出现少量釉质龋（发生率8.3%），未观察到牙本质龋。相关性分析显示，菌株的pH下降速率与大鼠牙本质龋发生率呈显著正相关（r=0.92，P<0.01），乳酸产量与龋齿严重程度的关联度最高（r=0.87，P<0.01）。
讨论与结论
本实验通过恒温恒湿培养系统精准模拟口腔微环境，发现不同口腔链球菌的产酸能力存在显著差异，其中变形链球菌的产酸速率最快，且乳酸作为主要代谢产物，可快速降低环境pH值。当牙菌斑内pH值低于5.5时，牙釉质表面的矿物质开始脱矿，长期处于酸性环境会导致龋齿病变从釉质向牙本质深入。实验结果证实，口腔链球菌的产酸能力与龋齿严重程度呈正相关，尤其是乳酸产量可作为预测龋齿风险的重要指标。
本研究为阐明龋齿发病的微生物学机制提供了实验支持，提示通过抑制口腔链球菌的产酸代谢或调节口腔微环境pH值，可能成为预防龋齿的有效策略。后续研究可进一步探索天然抗菌物质对口腔链球菌产酸能力的影响，为开发新型防龋产品奠定基础。
(责任编辑：luohe)
实验材料与方法
菌株与培养条件
选取临床分离的3株口腔链球菌标准菌株（变形链球菌ATCC 25175、血链球菌ATCC 10556、缓症链球菌ATCC 9811），均购自中国微生物菌种保藏中心。采用脑心浸液（BHI）培养基进行活化培养，恒温恒湿培养箱设定参数为37℃、相对湿度95%、5%CO₂，模拟人体口腔的生理环境。
产酸能力测定
将活化后的菌株接种至含2%葡萄糖的BHI液体培养基中，在上述恒温恒湿条件下分别培养2h、4h、6h、8h、12h、24h。采用精密pH计测定各时间点的培养基pH值，计算pH下降速率；同时通过高效液相色谱（HPLC）检测培养液中乳酸、乙酸等有机酸的含量，色谱条件为：C18色谱柱（250mm×4.6mm），流动相为0.02mol/L磷酸二氢钾溶液（pH 2.5），流速1.0mL/min，检测波长210nm。
龋齿模型构建
选用60只SPF级SD大鼠（体重180-220g），随机分为对照组、变形链球菌组、血链球菌组、缓症链球菌组，每组15只。实验组大鼠经口腔涂布相应菌株悬液（1×10⁸CFU/mL），每日1次，连续7天；对照组涂布等量无菌生理盐水。所有大鼠均给予致龋饲料（含56%蔗糖）和自由饮水，饲养环境温度25℃，相对湿度50%-60%。饲养4周后处死大鼠，剥离上下颌骨，采用Keyes龋齿评分法评估龋齿病变程度，统计釉质龋、牙本质浅龋及深龋的发生率。
实验结果
口腔链球菌的产酸动力学特征
在恒温恒湿培养条件下，3株口腔链球菌均表现出明显的产酸能力，但产酸速率与有机酸组成存在显著差异。变形链球菌在培养6h时培养基pH值从初始7.2降至4.5，pH下降速率达0.45/h，显著高于血链球菌（0.28/h）和缓症链球菌（0.21/h）（P<0.05）。HPLC检测显示，变形链球菌培养液中乳酸含量最高，24h时达32.6mmol/L，占总有机酸的78.3%；血链球菌和缓症链球菌的乳酸占比分别为65.2%和58.7%，且乙酸含量相对较高。
龋齿模型病变程度分析
4周饲养后，变形链球菌组大鼠龋齿发生率为100%，其中牙本质深龋发生率达68.5%，显著高于血链球菌组（32.2%）和缓症链球菌组（21.7%）（P<0.01）。对照组大鼠仅出现少量釉质龋（发生率8.3%），未观察到牙本质龋。相关性分析显示，菌株的pH下降速率与大鼠牙本质龋发生率呈显著正相关（r=0.92，P<0.01），乳酸产量与龋齿严重程度的关联度最高（r=0.87，P<0.01）。
讨论与结论
本实验通过恒温恒湿培养系统精准模拟口腔微环境，发现不同口腔链球菌的产酸能力存在显著差异，其中变形链球菌的产酸速率最快，且乳酸作为主要代谢产物，可快速降低环境pH值。当牙菌斑内pH值低于5.5时，牙釉质表面的矿物质开始脱矿，长期处于酸性环境会导致龋齿病变从釉质向牙本质深入。实验结果证实，口腔链球菌的产酸能力与龋齿严重程度呈正相关，尤其是乳酸产量可作为预测龋齿风险的重要指标。
本研究为阐明龋齿发病的微生物学机制提供了实验支持，提示通过抑制口腔链球菌的产酸代谢或调节口腔微环境pH值，可能成为预防龋齿的有效策略。后续研究可进一步探索天然抗菌物质对口腔链球菌产酸能力的影响，为开发新型防龋产品奠定基础。
(责任编辑：luohe)
