用恒温培养箱做质粒DNA提取实验

日期:2018-12-17 / 人气:

实验方法原理 

碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性,再将pH值调至中性使其复性,复性的为质粒DNA,而染色体DNA不会复性,缠结成网状物质,通过离心除去。 

实验材料 

大肠杆菌 

试剂、试剂盒 Tris-HclEDTA葡萄糖NaOHKAacNaAc异丙醇溶菌酶酚:氯仿无水乙醇LB培养基 
仪器、耗材 超净工作台、恒温培养箱、摇床、恒温水浴锅、台式离心机取液器、低温冰箱冷冻、真空干燥机、电泳仪水平电泳槽、紫外观测仪 
实验步骤
一、材料与试剂准备

1. 材料:大肠杆菌。

2. 仪器:超净工作台,恒温培养箱,摇床,恒温水浴锅,台式离心机,取液器一套,低温冰箱,冷冻真空干燥机,电泳仪,水平电泳槽,紫外观测仪。

3. 试剂:(1)Solution I :25 mM Tris-Hcl(pH7.4),10 mM EDTA(pH8.0),50 mM葡萄糖,高压灭菌,4℃保存。(2)Solution II :0.2 M NaOH, 1%SDS 现配现用。(3)Solution III :5 N KAc pH4.8,高压灭菌,4℃保存。(4)3 M NaAc pH5.2,高压灭菌,

4℃保存。(5)异丙醇,溶菌酶(8 mg/ml),酚/氯仿,无水乙醇,70%乙醇,LB培养基,电泳试剂。

二、操作步骤

1. 细菌繁殖:LB培养基,2 ml/20 ml,37℃,200 rpm,摇一摇,过夜。

2. 离心10 min,5 000 rpm, 4℃;弃上淸液。

3. 沉淀(菌体细胞)预冷的TES缓冲液洗涤,离心10 min,5 000 rpm, 4℃,加入预冷的1 ml Solution I,冰浴10 min。

4. 重新悬浮,加入150 ul溶菌酶母液,室温放置5 min。

5. 加入1.2 ml Solution II, 冰浴5 min。

6. 加入0.9 ml预冷乙酸钾,混匀,离心10 min,12 000 rpm,4℃。

7. 加入1.5 ml异丙醇,-20℃冰箱内放置15 min。

8. 离心10 min,12 000 rpm,4℃。

9. 取沉淀,悬于400 ul TE缓冲液中。

10. 加入40 ul,3 M NaAc。

11. 酚/氯仿,抽提,乙醇沉淀。

12. 离心10 min,12 000 rpm,4℃。

13. 取沉淀,冷冻干燥,再悬浮于50 ul TE缓冲液中。

14. 电泳检测提取DNA的质量。

作者:admin


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